德国Ozone疗法治疗特异性皮炎迅速改善

特异性皮炎(AtopicDermatitis，AD)是具有遗传倾向的一种过敏反应性皮肤病，特异性皮炎的多数患者由婴儿湿疹反复发作迁延而成，70%的患者家族中有过敏、哮喘或过敏性鼻炎等遗传过敏史，因此也被称为异位性湿疹、特应性皮炎、遗传过敏性皮炎、泛发性神经性皮炎等。特异性皮炎是一种具有慢性、瘙痒性、炎症性特点的皮肤病。

中南大学湘雅三院皮肤科鲁建云主任使用局部三氧水和三氧油外用治疗特异性皮炎取得了很好的临床效果，相关文献发表在国际免疫药理学杂志上。

国际免疫药理学杂志文献编译

局部三氧疗法可恢复特异性皮炎中微生物组的多样性

特应性皮炎（AD）是一种慢性和复发性炎症性皮肤病，涉及强烈的皮肤瘙痒症，p虫病和皮肤屏障损害。因此，它影响着患有各种疾病（例如睡眠障碍，焦虑症，社交退缩和抑郁症）的全球20％的儿童和10％的成人[1]，[2]。金黄色葡萄球菌（S.aureus）占AD患者病灶皮肤微生物组的90％，并导致AD频繁发作和疾病恶化[3]，[4]。此外，金黄色葡萄球菌的定植可能激活T辅助细胞2型（Th2）细胞，这是AD中的主要免疫表型[5]。。越来越多的证据表明，金黄色葡萄球菌的丰度在AD急性期显着增加，并且与疾病的严重程度密切相关。而其他主要的皮肤细菌群减少了，包括丙酸杆菌，棒状杆菌和马拉色菌[6]，[7]。研究表明，AD患者皮损和非皮损的皮肤微生物组的多样性与疾病的严重程度有关[8]。然而，营养不良如何影响AD的发作或发展仍未完全了解。最近出现的16SrDNA测序技术使我们能够以高通量的方式研究组成和皮肤微生物组[9]。三氧是一种经典的氧化剂和消毒剂，已在临床上得到广泛应用，涉及抗菌作用，抗氧化防御，免疫调节，表观遗传修饰，生物合成，镇痛药和血管舒张作用的机制[10]。三氧水和油已被广泛用于治疗炎症和感染性皮肤疾病，因为它可以迅速缓解瘙痒和水肿等症状，从而减轻疾病的严重程度[11]，[12]。在这项研究中，我们通过短期的局部三氧处理研究了微生物组多样性在AD病变中的作用，并探讨了潜在的益生菌和病原体。

该研究得到中医院的IRB委员会的批准。没有参与研究的补偿。年6月至年6月，AD医院皮肤科门诊就诊，经同意并签署书面同意书后才纳入研究。纳入标准包括：6–28岁，根据William标准[13]诊断为AD。通过特应性皮炎的严重程度评分（SCORAD）评估确定中度至重度AD；和双侧皮肤病变，尺寸大于4*4cm2在肘部或腋窝的两侧，与正常皮肤区域相邻。排除标准包括：对三氧水或油过敏；皮肤或其他破坏性皮肤病的严重感染；怀孕，母乳喂养或患有严重的系统疾病；在过去2周内使用皮质类固醇，免疫抑制剂或抗生素治疗。

在治疗过程中，将双侧肘前折痕，pop骨折痕或鼻腔上的病变，邻近的非病变和外鼻孔配对为目标部位。配对靶位的一侧随机选择为治疗组。而另一侧则被指定为对照组。治疗组的病变和非病变每天用三氧水（3.0±1.5mg/L）淋浴（HZ-B，湖南保健技术，中国长沙）处理15分钟，然后进行局部三氧处理的山茶花。每天两次（0522，过氧化物值为2,至2,mmol-当量/Kg，湖南保健技术，中国长沙）。每天每次治疗，将蘸有三氧水的棉签在鼻腔中旋转10次。病变对照组的非病变和鼻腔接受自来水淋浴和基础油的频率相同。干预持续了三天。在治疗前后，收集临床照片，SCORAD，客观SCORAD，改良的湿疹面积和严重程度指数（EASI），反射共聚焦显微镜（RCM）图像以及微生物组采样。

疾病严重程度由SCORAD评估[14]。客观SCORAD用于评估全身病变的严重程度。通过改良的EASI评估靶位。评估了靶向部位的四个特征：红斑，浮肿，苔藓样变和脱落。根据其严重程度，每个特征均得分为0–3分：无，轻度，中度和重度。总数是四个类别的总和[15]。

从每位AD患者的不同部位取用无菌盐水浸湿的无菌棉签。垂直擦拭皮肤10次，收集皮肤样品。通过将拭子在前鼻孔中旋转10次来采集鼻腔样品。所有病变样品均取自肘前和pop折处可见的湿疹。所有非病变样品均取自邻近的正常皮肤。

通过BGI基因组学试剂盒（中国北京，北京基因组研究所）分离了拭子中的DNA，并将其保存在-80°C下以备将来使用。用以下引物扩增16SrDNA基因的V4区，以生成每个样品F（5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3）和R（5-GGACTACHVGGGTWTCTCTAAT-3）的扩增子文库[16]。如先前所述[17]进行PCR扩增，克隆和测序。使用AgencourtAMPureXP（Beckmancoulter，CA，USA）选择合适大小的DNA文库片段，并使用Bioanalyzer-（AgilentTechnologies，CA，USA）进行鉴定，并使用Hiseq-（Illumine）进行双末端测序Inc.，CA，USA）[18]。

将所有收集的样品放入无菌试管中，然后迅速运送到临床实验室进行细菌培养。在无菌的超干净工作台中从棉签上取下收集的标本，并浸入灭菌的NaCl溶液（0.9％）中3次。将样品以12，rpm/min的速度离心10分钟以保持沉淀，然后在血琼脂平板中接种（Sigma-Aldrich，MO，美国）。将板在37℃下孵育48小时。

从板中挑出单个菌落以进行质谱分析（Bruker，NASDAQ，USA），以根据制造商的说明确定细菌种类。

高质量的配对末端读段按标签分类[19]，通过使用USEARCH（v7.0.），它们以97％的相似性聚类到OTU中。使用核糖体数据库项目（RDP）分类器（v2.2）注释OTU序列，其置信度值为0.60[20]，[21]。最后，使用α多样性，β多样性和不同物种筛选来区分基于OTU和分类等级的分类。

在族和属水平上分析了超过10,个OTU或标签的前25个丰富度，以避免受污染的物种远不那么丰富。丰度的组成变化用于描述模式和趋势。α多样性指数由Mothur（v1.31.2）评估。香农多样性分析被用来评估微生物组的丰富度（不同物种的数量）和均匀度（它们的分布均匀度），作为本研究的主要指标[22]。

通过PAWSStatistics18.0（IBM，NY，美国）进行统计分析，并使用GraphpadPrism7（GraphPadSoftware，CA，美国）制作图形。组间SCORAD，OTU量和香农多样性的差异通过配对t检验进行了检验。不同的靶位点的库生成速率与χ测试2测试。使用相关和偏相关分析来分析相关因素。除非另外指出，否则所有数据均表示为平均值±SEM。小于0.05的两尾P值被认为具有统计学意义。

本研究共纳入12例AD患者（6到28岁的4例男性和8例女性）（表1）。从肘前折痕收集了一半的AD病变和非病变皮肤样品。一半来自平民折痕。皮肤细菌培养表明，患者的12个病变中有7个发现了金黄色葡萄球菌（SF.1A）。还发现了表皮葡萄球菌（S.epidermis）和头皮葡萄球菌（S.capitis）（SF.1B＆C）。在8名AD患者中发现了过敏性鼻炎或哮喘病史。

表1。入选受试者的临床特征。

干预前，以斑丘疹，糜烂和渗出为主要表现的病变主要分布在四肢屈曲中。皮肤干燥是在这些患者中观察到的普遍现象。治疗后，观察到炎性丘疹和水肿减弱（图1A）。在RCM下，与治疗前相比，治疗后表皮中观察到较少的浸润性炎性细胞（图1B）。为了评估三氧疗法对AD严重程度的影响，我们估算了SCORAD和改良的EASI。三天治疗后SCORAD下降了22.15％（95％CI，P=0.1）（图1C）。治疗组和对照组病变的改良基线EASI分别为5.17±2.23和5.13±2.14（95％CI，P＞0.05）。干预后，该指数分别降低了48.0±18.6％和15.0±8.9％。因此，三氧疗法可以显着减轻AD病变（95％CI，P0.）（图1D）。

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图1。三氧对AD患者的局部治疗。（A）在对照组和治疗组中，三氧干预后对AD皮肤病变的临床疗效。临床图像取自同一受试者的双侧pop折痕。（B）（A）中病变的RCM图像。治疗前观察到大量炎性细胞（黄色箭头）渗入表皮。干预后，与对照组相比，治疗组的炎症细胞较少。（C）所有AD患者在治疗前后的SCORAD统计图。符号中的数字代表患者的分配编号。来自治疗前后的同一受试者的数据集通过虚线连接。（D）干预后不同组的病变指数降低。P通过两尾配对t-检验计算值。（有关此图例中颜色参考的解释，请参考本文的网络版本。）

Shannon多样性和客观SCORAD之间的关联用于研究微生物多样性与疾病严重程度之间的可能关系。考虑到前折痕和pop折痕都是AD的易感部位，并且具有相似的结果，因此我们对每个受试者的这些部位进行平均，以进行分析，以避免重复计算。我们发现SCORAD和病变的Shannon多样性之间呈负相关，根据疾病状态进行调整（r=-0.，P=0.）（图2A）。该数据表明严重AD的易感部位具有较低的皮肤细菌多样性。

图2。AD中的微生物组多样性。（A）AD患者病灶中客观SCORAD与Shannon多样性之间的关系。（B）不同群体中的香农多样性。来自治疗前后的同一受试者的数据集通过虚线连接。通过两个指示的组之间的两尾成对t检验来计算P值。

我们发现，与病变部位和鼻部位相比，非病变部位的细菌多样性最大（95％CI，P0.05）（图2B）。然后，我们通过三氧疗法对AD的病变，非病变和鼻腔进行了皮肤微生物学效果的进一步研究。我们发现三氧处理显着提高了病变部位的香农指数，但没有增加鼻腔和非病变部位的香农指数（图2B）。因此，三氧疗法可以恢复AD病变中微生物组多样性的降低。

我们筛选了每个病变样本中最丰富的25个OTU。在AD病变中发现了四个主要门，例如放线菌，拟杆菌，硬毛和变形杆菌中的总共18属。属水平的组成变化示于图3A。在AD病变的基线处，葡萄球菌在病变微生物学中占主导地位，根据从皮肤中培养的微生物来看，其占59％至99％。治疗后葡萄球菌百分比降低（P=0.07，图4A）。金黄色葡萄球菌的比例AD病变中的Aβ与疾病的严重程度部分相关（r＝0.，P＝0.，图5A）。此外，治疗后AD病变中不动杆菌的丰度也下降（P=0.，图4B），但与疾病严重程度的相关性不显着（r=-0.，P=0.）（图5B）。。有趣的是，棒状杆菌与病灶的严重程度没有相关性（r=0.，P=0.）（图5C），并且在治疗后的病灶中其比例没有显着降低（图4B）。我们还观察到了乳酸杆菌，链球菌和丙酸杆菌的轻微下降（图4C）。在AD患者的鼻腔中发现葡萄球菌大量定殖，同时以棒状杆菌，莫拉氏菌和丙酸杆菌为主要属（图3B）。金黄色葡萄球菌的比例略有下降，但与严重程度的相关性不显着（P=0.，图5）。D）。要注意的是，在疾病缓解期间，其在受试者AD07中的丰度甚至增加了。我们还观察到那些受试者的非病变中的细菌多样性，其显着高于病变部位（P0.05，图2B）。上述18个属的非病灶仅占55.3±30.76％，而病灶则为85.6±15.8％。非病灶中葡萄球菌仍是主要成分，占31.55±30.76％。在三氧治疗后，其丰度降低了，但微不足道（图4A）。应当注意，受试者AD06和AD09中的葡萄球菌在治疗后的病变和非病变中均增加。

图3。治疗前后AD皮肤病变中皮肤和鼻腔中细菌种类的比例分布。（A）治疗前后AD皮肤病变的主要丰富细菌种之间的微生物组多样性的再平衡。（B）治疗前后鼻腔中不同微生物组的相对丰度。未成功获得病变部位AD12、04，鼻腔03的数据。

图4。AD病变或非病变皮肤治疗前后主要微生物种类的变化。治疗后病灶中葡萄球菌的成分百分比没有明显减少；治疗前后非病变皮肤无明显变化。（B）在治疗后，不动杆菌和棒状杆菌在AD病变中的比例分别显着或不显着增加。（C）乳酸杆菌和丙酸杆菌在AD病灶中治疗后的比例百分比无明显增加。来自治疗前后的同一受试者的数据集通过虚线连接。

图5。主要细菌属百分比与客观SCORAD之间的相关性。（A）葡萄球菌的比例百分比与AD的疾病严重程度呈正相关。（B）不动杆菌和（C）棒状杆菌在其丰度和AD严重性之间均未显示出显着相关性。（D）在鼻腔中葡萄球菌丰度与疾病严重程度之间的相关性不显着。符号中的数字代表患者的分配编号。

皮肤微生物组的失衡已显示会影响AD的炎症和免疫反应，从而加剧其严重程度[23]，[24]。金黄色葡萄球菌在皮肤中的定植与AD的恶化和复发有关[25]。金黄色葡萄球菌可剥夺痤疮丙酸杆菌（一种重要的皮肤微生物组成员），通过产生分泌性毒力因子来传播其入侵，并引起内源性表皮蛋白水解和皮肤屏障破坏[26]。在这项研究中，我们观察到葡萄球菌比例显着增加中度至重度AD病变的微生物组组成中的微生物含量升高，可通过短期局部三氧疗法逆转。我们的结果表明，三氧疗法不仅具有杀菌作用，而且还涉及AD病变皮肤微生物多样性的恢复。我们先前的研究发现，负载金黄色葡萄球菌减少75.55±21.81％后局部三氧处理3天后为AD[27]。本研究进一步分析了三氧干预前后鼻，病变和非病变区域微生态多样性的变化。总体而言，我们观察到治疗组的微生态多样性与基线相比有所增加。一致地，非病变区域的细菌多样性也高于病变区域和鼻腔。

不动杆菌是一组条件致病细菌。在以前的报告中，已证实轮虫可以诱导树突状细胞的免疫耐受并抑制T辅助1型（Th1）细胞的极化，从而减少小鼠的过敏反应[28]。最近的另一项研究表明，罗汉草可以刺激单核细胞和角质形成细胞产生白介素10，从而调节Th1/Th2细胞分化的平衡并发挥抗炎作用[29]。在这项研究中，我们证明了不动杆菌的比例三氧处理后该物种升高，表明其与疾病严重程度负相关。这些数据与上述报告一致。不动杆菌的上调可能是三氧去除葡萄球菌的次要结果。

三氧最初是在医学中用作杀灭微生物的强氧化剂。迄今为止，该活性分子已被广泛用于治疗包括皮肤疾病在内的50多种病理疾病[30]，[31]。三氧作用的机制可能涉及直接的抗菌作用，免疫调节，抗氧化剂防御，表观遗传修饰，止痛药，生物合成和血管舒张[10]。在我们的研究中，我们显示了短期三氧局部治疗对中度至重度AD的疗效，这可能部分归因于皮肤微生物群多样性的恢复。特别是，三氧可以作为抗菌剂来减少葡萄球菌，随后通过增加三氧来平衡皮肤的微生态。不动杆菌改善病变中的皮肤状况。三氧处理引起的皮肤微生态多样性的恢复可能有助于修复皮肤屏障功能并改善免疫系统以缓解炎症反应。此外，三氧可以用作消毒剂，从而降低AD病原菌干扰和细菌耐药性的风险。在这项研究中，我们发现AD患者的鼻微生态多样性差于皮肤表面，并且大多数患者都有葡萄球菌定植。在鼻腔三氧干预过程中，葡萄球菌与AD状态之间无显着相关性。为了回答这个问题，需要进行一系列的后续实验。

这项研究的局限性包括：（1）样本量不足，无法减少由于易受环境因素影响的皮肤微生物个体变量引起的差异；和（2），其可以导致的代表性不足16SrDNA序列V4-标签测序的局限性表皮葡萄球菌和丙酸和的比例过高金黄色葡萄球菌[32]。因此，我们的结果可能无法准确反映治疗前后皮肤中表皮葡萄球菌和丙酸杆菌的变化。但是，考虑到金黄色葡萄球菌的事实占AD病变中微生物组的90％，这是本研究的主要重点，并且可以通过V4标签序列加以丰富，因此不应破坏本研究得出的结论。然而，在我们未来的研究中，有必要使用16SrDNAV1-V3标签测序来进一步研究响应三氧处理的皮肤病变中的微生物组图谱。

总之，我们在这里报道了局部三氧治疗AD可以迅速改善症状，包括减轻瘙痒和减轻炎症。葡萄球菌的比例与AD严重程度呈正相关。三氧干预可以通过增加不动杆菌的比例来降低葡萄球菌的丰度，并增加AD病变的微生态多样性，从而减轻疾病。

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详情阮老师

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